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基因编辑犬模型

Gene editing dog model

心脑血管疾病模型
心脑血管疾病是一种严重威胁人类的疾病,全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人,居各种死因首位。以ApoE基因编辑犬为代表的广泛性动脉粥样硬化模型,在正常饮食的饲喂条件下,出现了颅内动脉粥样硬化、全身多处血管斑块和狭窄、脑卒中、下肢坏疽等临床表型。可以以此模型为基础进行动脉粥样硬化和继发症的相关研究。
1. ApoE基因编辑犬|全身动脉粥样硬化模型

背景信息


1

动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是由遗传、环境等多因素导致的老年多发性疾病。随着人们生活水平的不断提高,动脉粥样硬化的发病率逐年提升,且呈现年轻化的趋势,其中由冠状动脉粥样硬化、颅内动脉硬化引发的冠心病和脑血管疾病成为人类的主要杀手。在众多的发病因素中,脂质代谢紊乱、尤其是高胆固醇血症与其关系最为密切。


2

ApoE基因

ApoE基因是血浆脂蛋白的重要组成部分,对脂质在细胞内代谢和分布有重要调节作用,特别是与机体内胆固醇的代谢密切相关。ApoE的低表达或缺失将导致血脂含量的增高,从而诱导动脉粥样硬化疾病。近年来,ApoE基因敲除小鼠已成为研究AS发病机制及抗AS药理学研究等方面重要的动物模型之一。虽然小鼠作为AS疾病模型有着广泛的应用,但由于小鼠与人类亲缘关系较远,寿命短,在体型大小、生理结构、生化指标及脂类代谢途径上与人类有较大差异,难以准确模拟人类疾病的发生及治疗过程,因此在AS的相关研究中尚无准确模拟AS疾病的动物模型。


通过对犬进行全基因组测序分析,共计确定约1.93万个基因,其中有1.8万个基因与人类已知基因相同,高于小鼠等其他实验动物,并且犬在脂类代谢、生理解剖等方面与人类相似,是人类心脑血管疾病研究理想的模式动物。因此,开元ky888下载针对ApoE基因第3号外显子进行基因编辑,获得了4只F0代基因编辑犬:ApoE第3号外显子双等位基因突变-34bp/+17bp和-2236bp。



模型犬F0代结果


1

高血脂

4只F0代出生后始终呈现高胆固醇、高低密度脂蛋白的高血脂表型。

出生后30天血脂(已经发表数据)

1.5~2 岁血脂(尚未发表数据)


2

动脉粥样硬化及并发症

血管B超:


F0代在接近2周岁时进行血管超声检查,结果显示ApoE基因编辑犬右侧颈内动脉起始段后壁探及6.5×1.2mm等回声扁平斑块(图A),流速24/6cm/s(图B),颈内动脉流速20/6cm/s;左侧颈内动脉起始段后壁探及4.1×1.2mm斑块(图C),流速21/6cm/s,呈“振荡型”血流频谱(图D),颈内动脉流速11/6cm/s,呈“振荡型”血流频谱。腹主动脉后壁探及19.9x1.3mm等回声扁平斑块,肾动脉、髂动脉、股浅动脉均可探及不同大小的斑块,血管不同程度的狭窄。


颈内动脉粥样硬化(尚未发表图片)


核磁共振(MRI):


MRI结果显示ApoE基因编辑犬(Mutant 1)脑梗死。图A和图B箭头所示左额叶、顶叶和颞叶有7.41 ml的大面积梗塞,图C和图D中的箭头表示左基底神经节有1.14 ml的新鲜、急性缺血性梗塞。


脑梗死(尚未发表图片)


剖检结果:


1. F0代在均在2周岁左右死于动脉粥样硬化引发的心、脑血管疾病。剖检发现:由于冠状动脉狭窄、心肌纤维缺血缺氧导致心肌纤维化、心腔扩张。


冠状动脉粥样硬化(尚未发表图片)

注:LCA left coronary artery,左冠状动脉。


2. 两侧颈内动脉、颈外动脉均可见粥样斑块,Mutant 1左侧颈内动脉斑块处可见继发血栓形成(图A)。


 颈动脉粥样硬化(尚未发表图片)

注:LECA left external carotid artery,左侧颈外动脉;LICA left internal carotid artery,左侧颈内动脉;LCCA left carotis communis artery,左侧颈总动脉。RECA right external carotid artery,右侧颈外动脉;LICA right internal carotid artery,右侧颈内动脉;LCCA right carotis communis artery,右侧颈总动脉。


3. 基底动脉、大脑前动脉均可见粥样斑块,Mutant 1 基底动脉处可见继发性血栓形成(图B),剖检结果与其生前MRI检查结果相对应。

颅内动脉粥样硬化(尚未发表图片)

注:BA basilar artery,基底动脉;RCA rostral cerebral artery,大脑前动脉


4. 由于模型犬髂动脉、股动脉粥样硬化、血管狭窄,导致后肢供血不足,足背动脉闭塞,后肢坏疽。


坏疽(尚未发表图片)


病理结果:


ApoE模型犬左侧颈内动脉管腔中存在大量红细胞(“*”所示)、胆固醇晶体(“→”所示)和斑块组成的血栓(图B)。基底动脉内膜层明显增厚,管腔内膜下有大量泡沫细胞聚集,胞质内含有大量小空泡(“#”所示),管腔几乎闭塞(图D)。



ApoE基因编辑犬自出生后始终呈现总胆固醇高、低密度脂蛋白高的高血脂表型,血管B超可见颈内动脉、腹主动脉、肾动脉、髂动脉、股浅动脉等全身多处动脉粥样硬化斑块,多数模型犬晚期后肢供血不足、发生坏疽。该模型使用临床降脂药物辛伐他汀可有效降低总胆固醇、低密度脂蛋白。剖检发现模型犬基底动脉、大脑前动脉迂曲钙化、粥样硬化,严重者甚至出现颈内动脉和基底动脉血栓、脑梗死。ApoE基因编辑犬表型较大程度的模拟了临床动脉粥样硬化并发心、脑血管疾病患者的表型,并且对人类使用降脂药物治疗敏感,是较为理想的动脉粥样硬化相关疾病研究的动物模型。


3

种群数量

F0\F1\F2\F3共120只;


4

模型应用

一、 利用模型犬,进行以下方面致病机制的研究:


1. 动脉粥样硬化的发病机制机理;

2. 在ApoE模型犬的基础上,创建多基因编辑(如SR-BI基因、Akt基因、PDGFRβ基因等)动脉粥样硬化模型犬,深入研究动脉粥样硬化的发病机制机理;

3. 动脉粥样硬化并发心血管疾病、脑血管疾病发病机制机理;

4. 微血管病变并发症如:认知障碍等发病机制机理。


二、 利用模型犬,开展药物有效性评价与新药开发实验:


1. 评估药物对血脂的影响;

2. 评估药物对斑块形成的影响;

3. 评估药物对动脉粥样硬化并发心血管疾病、脑血管疾病的治疗效果;

4. 评估药物对动脉粥样硬化并发认知障碍的治疗效果等。


三、 利用模型犬,开展医疗器械、外科手术等非药物治疗有效性实验与评价;


四、 在模型犬的基础上,通过饮食诱导、外科手术等方式诱导其他疾病动物模型。




1. Scn5a基因编辑犬|心源性猝死模型

背景信息


1

心源性猝死

心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)是指急性症状发作后1小时内发生的以意识突然丧失为特征的由心脏原因引起的自然死亡。其特点有三:①死亡急骤,②死亡出人意料,③自然死亡或非暴力死亡。心源性猝死者绝大多数患有器质性心脏病,主要包括肥厚型和扩张型心肌病、心脏瓣膜病、传导异常(QT间期延长综合征、心脏阻滞)和严重室性心律失常等。某些因素如过度劳累、情绪压抑等,都可触发心源性猝死。


2

SCN5A基因

SCN5A基因负责编码钠通道蛋白的ɑ亚单位(Nav1.5),Nav1.5调控着心肌细胞的钠内流, Nav1.5除影响到钠内流和细胞除极外,还和诸多的心肌细胞骨架蛋白、肌节蛋白相互联系,因而,SCN5A基因突变导致的Nav1.5结构的异常,不但会引起心脏节律的异常,还可导致心脏结构的异常。研究报道:SCN5A基因突变可以导致Brugada综合征、致心律失常性右心室心肌病/发育异常(ARVC/D)、QT间期延长综合征、传导阻滞等心脏疾病。Brugada综合征右胸导联具有特征性的类右束支传导阻滞样图形,呈现为穹窿样或马鞍样ST段抬高。心律失常性右室心肌病/发育异常(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia,ARVC/D)以容易合并恶性心律失常及心脏纤维脂肪化为特点。LQT综合征特征性表现为QT间期延长,LQT3综合征易发生睡眠中猝死。以上疾病易合并室速、室颤等恶性心律失常,为导致人类心源性猝死的杀手。因此开元ky888下载需要积极寻找心源性猝死的致病原因,根据其致病基因构建动物模型,阐明心源性猝死的发病机制,为疾病的有效诊断和早期干预提供科学依据。开元ky888下载针对家犬Scn5a第2号外显子使用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,最终获得-2 bp和+9 bp基因编辑模型。


模型犬F0结果


1

 心电图异常

Scn5a基因突变模型犬在出生后表现出PR间期延长、QRS波宽等心电特征。


2

 模型应用

一、 利用模型犬,开展相关课题研究,通过DNA、RNA分子水平、心电生理水平、心肌病理水平等多方面深入研究心源性猝死发病机制机理;


二、 利用模型犬,对心源性猝死诱发因素进行全面评估,例如:对运动量、运动项目与心源性猝死之间的关系进行评估与分析,为运动员等高危人群避免心源性猝死的发生提供科学依据;


三、 利用模型犬,通过早期、连续动态监测心电图、心脏超声,为心源性猝死的临床前诊断和早期干预提供客观、科学依据;


四、 利用模型犬,开展药物有效性实验与评价:


1. 评估药物延缓心肌纤维化的效果;

2. 评估药物预防恶性心律失常的效果;

3. 评估药物对猝死早期干预的效果。


五、 利用模型犬,开展相关研究进行新药研发:


六、 利用模型犬,开展非药物治疗有效性实验与评价:


1. 评估运动量对心源性猝死的预防效果;

2. 评估干细胞治疗对心源性猝死的预防效果;

3. 评估介入性医疗器械对恶性心律失常的治疗效果;

4. 评估外科手术对恶性心律失常的治疗效果。

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